MATRIZ DE BIOCERÁMICA DE FOSFATO CÁLCICO INTELIGENTE PARA INGENIERÍA DE TEJIDO ÓSEO

Guy Daculsi1,a, Thomas Miramond11,2,b, Pascal Borget2,c, Serge Baroth2,d

1INSERM U791, LIOAD, Facultad de Cirugía Dental, Nantes, Francia

2Biomatlante, ZA des 4 Nations, Vigneux de Bretagne, Francia

aguy.daculsi@univ-nantes.fr; bthomas.miramond@etu.univ-nantes.fr, cpascalborget@biomatlante.com; dsergebaroth@biomatlante.com

Palabras Clave: fosfato cálcico bifásico, microporoso, macroporoso, matriz, ingeniería de tejidos.

SUMARIO

El desarrollo de cerámica de CaP conllevó un mejor control del proceso de reabsorción y sustitución ósea. El CaP Bifásico Micromacroporoso (MBCP+TM) es un concepto basado en un balance óptimo de la fase más estable ce HA y TCP más soluble. El material es soluble y se disuelve gradualmente en el cuerpo, sembrando la nueva formación de tejido óseo al liberar iones de Ca y P al medio biológico. El MBCP+ fue seleccionado para ingeniería de tejido en un programa de investigación europeo de gran tamaño sobre la osteoconducción y tecnologías de células madre mesenquimatosas (Séptimo Programa de trabajo del marco de la UE REBORNE, defectos Óseos Regenerativos utilizando nuevos enfoques de ingeniería biomédica, www.reborne.org). Hemos optimizado las matrices con respecto a sus propiedades físicas, químicas y cristalinas, para mejorar la colonización celular e incrementar el crecimiento interno de tejido óseo cinético. La rápida colonización celular y reabsorción de material está asociada con la estructura interconectada de macroporos, que maximiza el proceso de sustitución ósea por reabsorción. El contenido de microporos involucra la difusión de líquidos biológicos y superficies de absorción apropiadas para la circulación de factores de crecimiento.

La biocerámica desarrollada para este proyecto fue completamente caracterizada utilizando difracción de rayos X, espectroscopía infraroja transformada de Fourier, microtomografía de rayos X, porosimetría de Hg, superficie específica de BET, pruebas de compresión mecánicas y microscopía electrónica de barrido. Se realizaron pruebas preclínicas en la matriz optimizada en defectos de tamaño crítico en distintos sitios de implantación y animales (ratas, conejos, cabras, perros). La matriz inteligente tiene una porosidad total de 73%, constituida de macroporos (>100µm), mesoporos de 10 a 100µm and high y alto contenido de microporos (<10µm) de más o menos 40%. El tamaño de cristal es de <0.5 a 1µm y la superficie específica fue alrededor de 6m2/g. El experimiento in vivo indicó una mayor colonización por células osteogénicas, demostrando matrices apropiadas para la ingeniería de tejidos.

La proporción de HA/TCP de 20/80 fue también más eficiente para su combinación con médula ósea total o cultivo y expansión de células madre previo a su implantación. Introducción Existe amplia evidencia de que la capacidad intrínseca de MSc de activar los mecanismos regenerativos endógenos y reclutar células receptoras en un modelo de formación ósea ectópico es críticamente dependiente de la tecnología de MSC, pero también de las propiedades fisicoquímicas y estructurales de las matrices [1,2]. No obstante, para el éxito del transplante de MSC, la naturaleza y estructura de las matrices en las que se siembran las células es altamente crítica. Por tanto, adicional a representar un portador tridimensional para las células y una matriz con la forma correcta dentro de la cual se forma el nuevo tejido, las matrices son cruciales para determinar el microambiente óptimo para que la célula pueda expresar por completo su potencial regenerativo. Se tiene en progreso un gran Proyecto Colaborativo del séptimo programa marco (tema SALUD-2009-1.4.2 sobre defectos de Hueso Regenerativo utilizando nuevos enfoques de Ingeniería Biomética, REBORNE, coordinator P. Layrolle) para explorar estos campos clínicos y científicos. El principla objetivo de esta propuesta es desarrollar nuevos biomateriales que estimulen la formación de tejido óseo en combinación con células madre adultas para la regeneración de defectos óseos en cirugía ortopédica y maxilofacial.

Hemos optimizado las nuevas matrices basadas en un concepto micromacroporoso de Fosfato Cálcico Bifásico (MBCP) con una microestructura altamente adaptable para las técnicas de ingeniería de tejidos que muestra propiedades osteogénicas mejoradas. En distintos modelos animales, una mezcla de gránulos de MBCP y médula ósea total pareció ser la más eficiente de entre todos los materiales evaluados para sustitución ósea en situaciones difíciles, como áreas irradiadas, radionecrosis [3,4]. El desarrollo de cerámica de CaP para injerto óseo conlleva un mejor control del proceso de reabsorción de biomateriales y sustitución ósea. Los biomateriales de injerto óseo son principalmente representados por hidroxiapatita de fosfato cálcico HA, fosfato tricálcico TCP y CaP bifásico, MBCP. El concepto basado en cerámica bifásica de CaP se alcanza mediante un balance óptimo de la fase más estable de HA y TCP más soluble. El material es soluble y se disuelve gradualmente en el cuerpo, sembrando una nueva formación de tejido óseo al tiempo de liberar iones de Ca y P al medio biológico [5]. Estos compuestos de biocerámica se utilizan principalmente para la reconstrucción ósea, y resultan especialmente optimizados para médula de combinación durante cirugía o para ingeniería de tejido ósea utilizando células madre. Hemos optimizado matrices en términos de sus propiedades fisicoquímicas y cristalinas con el fin de mejorar la colonización celular e incrementar el crecimiento interno cinético óseo.

La rápida colonización celular y reabsorción del material están asociadas con la estructura interconectada de macroporos, que maximiza el proceso de sustitución ósea por reabsorción. El contenido microporoso conlleva la difusión de líquidos biológicos y superficies apropiadas de absorción para la circulacuión de factores de crecimiento. El objetivo de este estudio fue el presentar el enfoque científico de matrices en el proyecto europeo REBORNE, y por qué la biocerámica de MBCP+ ha sido seleccionada para el proyecto en tecnologías de células madre y pruebas clínicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cerámica de CaP Bifásica Micromacroporosa (MBCP+, marca CE y FDA 510k, Biomatlante SA, Francia) fue una mejora de la tecnología de biocerámica de fosfato cálcico micromacroporoso desarrollada hace veinte años [5]. En poco tiempo, el CDA de apatita deficiente de CaP se asoció con una mezcla de partículas selectas de porógeno. Posterior a un compactamiento isostático, el bloque fue sinterizado de acuerdo a un proceso específico de sublimación/calcinación en bajas temperaturas. La baja temperatura de sinterización presenta ventajas en la preservación del alto contenido microporógico y menor densidad cristalina que temperaturas más altas de sinterización [6]. La biocerámica obtenida fue caraterizada mediante el uso de rayos X, espectroscopía infraroka transformada de Fourier, microtomografía de rayos x, pruebas de permeabilidad, porosimetría de Hg, pruebas de superficie específica BET, evaluación mecánica y microscopía electrónica de barrido. Se observó y analizó la estructura cristalina en la nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (hrTEM) y difración electrónica (ED). Los gránulos de MBCP+ han sido evaluados en distintos estudios preclínicos en cabras, conejos y ratas, con o sin adición celular (médula osea tota, células madre mesenquimatosas) en defectos de tamaño crítico de epífisis femoral, y sitios de tejido no óseo para evaluar las propiedades osteogénicas/osteoinductivas. Los implantes retirados fueron analizados mediane microtomografía computarizada, tomografía electrónica de barrido y análisis de imagen para histomorfometría, y se realizaron múltiples publicaciones sobre la biocompatibilidad, eficacia y desempeño en modelos animales y en aplicaciones clínicas en humanos [7].
Resultados La difración de rayos X solo mostró contenido de Hidroxiapatita y β-TCP. La proporción HA/TCP medida fue de 20/80 (figura 1). Non se observó ningún rastreo de otra especie de fosfato cálcico.

Figura 1: MBCP+ XRD

La espectroscopía infraroja transformada de Fourier confirma el alto nivel de pureza de HA y TCP sin carbonatos (figura 2).

Figura 2: MBCP+ FTIR

Se determinó el tamaño y forma de cristal, así como la distribución de micro y macroporos mediante microscopía electrónica de barrido (figura 3). Las numerosas concavidades de los gránulos incrementaron la superficie desarrollada para colonización celular. A nivel cristalizado, se observó un tamaño homogéneo de cristales con una elevada cantidad de espacios entre cristales (microporos) completamente interconectados (figura 4). Los cristales individuales observados no son representativos de un cristal individual de HA o TCP, lo que confirma una mezcla íntima de HA/TC en la síntesis de la matriz inteligente de MBCP+.

Figura 3
Figura 4

Utilizando el estudio de hrTEM de un solo cristal de HA/ TCP, fuimos incapaces de observar un cristal separado de HA o TCP. El único cristal observado es una mezcla molecular (dominios nanocristalográficos) constiutida por el compuesto bifásico (figura 5). La difración electrónica de haz convergente no presentó resolución suficiente para caracterizar con precisión el dominio de HA o β-TCP domain; las dos organizaciones cristalográficas fueron íntimamente asociadas en los cristales individuales.

Figura 5: estudio de hrTEM que muestra un plano en retícula de HA/TCP. Se observan numerosas barreras granulares entre los cristales de BCP (flecha). en la figura b, la difracción electrónica indica una mezcla íntima molecular de HA y TCP.

El tamaño de cristal es de 0.5 µm y su superficie específica es de 6 m2/g para MBCP+. Las pruebas de compresión mostraron 4 MPa. La positomegría de mercurio se reporta en la tabla 1.

Las interconexiones están evidenciadas por una reconstrucción en 3D utilizando microtomografía cuantitativa y cualitativa (figura 6). Figura 6: reconstrucción en 3D de un bloque de MBCP+ La incubación con suero bovino indicó un incremento del 30% de la absorción de líquido biológico con la matriz inteligente MBCP+ en comparación con MBCP clásico.

Figura 6

Se observó un mayor crecimiento interno de los macroporos con la implantación a corto placo de MBCP+ en comparación con MBCP clásico. Después de 12 semanas, no se encontró diferencia estadística alguna entre los dos tipos de implantes. La tasa de reabsorción es mayor para MBCP+: 17% contra 12% a 6 semanas, y 19% contra 17% después de 12 semanas (sin diferencia significativa) [5].

Esta cinética de crecimiento óseo interno a expensas del MBCP+ se confirmó en casos clínicos en humanos (figura 7).

Figura 7: microscopía óptica, elevación del seno posterior a 4 meses de implantación, lo que muestra nueva formación ósea (flech larga, en rosa) a expensas de los gránulos de MBCP+ (*), particularmente en la concavidad de los mismos (flecha delgada).

DISCUSIÓN

Se ha demostrado recientemente que algunos compuestos de biocerámica con microestructuras particulares inducen la formación ósea posterior ala implantación en regiones de tejido no óseo en modelos animales de gran tamaño [8-11]. En sitios de tejido óseo, los mismos materiales tienen propiedades regenerativas superiores que otros compuestos biocerámicos o aloinjertos y autoinjertos. Aparentemente, la baja diferencia en porosidad total (3%) entre la matriz clásica de MBCP y la matriz inteligente es que los tipos de MBCP+ no pueden explicar una mayor permeabilidad y propiedades osteogénicas.

La mayor permeabilidad y habilidad de absorción se debió esencialmente a la distribución del tamaño del poro, particularmente mesoporos y el alto contenido de microporos, que representa alrededor del 40% de la porosidad total. Posterior a la implantación, se observó crecimiento interno del hueso a expensas de la biocerámica, y el tejido óseo recién formado progresivamente reemplazó el material bioactivo, seguido de una remodelación del hueso haversiano [5]. Los experimentos in vivo indicaron una alta colonización celular por parte de células osteogénicas debido a su estructura interconectada y microporosa asociada con una mayor solubilidad. Adicionalmente, un previo estudio comparativo con macro y microestructuras comparativas de distintas biocerámicas de fosfato cálcico (HA, TCP o BCP 60/40 y BCP 20/80) demostró que la mejor matriz fue una proporción de 20/80 para ingeniería de tejido (ej. combinación con cultivo de células madre y expansión), y posterior implantación en el sitio de tejido óseo [1]. Las propiedades osteogénicas u osteoinductivas de la cerámica de fosfato cálcico con una óptima micro y macroporosidad han sido también demostradas sin combinación celular posterior a la implantación en un sitio sin tejido óseo (área muscular) [8, 10, 11]. Ripamonti ha postulado también que la geometría del material (concavidad) es un parámetro crítico en la inducción ósea [12].

Los eventos y el origen de estas importantes propiedades osteoconductivas son la disolución de la fase más soluble, la liberación de iones de Ca y P y la posterior precipitación de apatita biológica concentrando los factores locales de crecimiento [12]. Las células osteoprogenitoras podrán, por otra parte, reconocer la capa de apatita ósea formada en vivo mediante la reprecipitación de la solución en el material y producir un hueso mineralizado. La cinética del crecimiento interno óseo por diferenciación de células osteogénicas necesita desarrollarse dentro de los macroporos. Sin macroporos y mesoporos, los procesos bioactivos son incapaces de desarrollarte en la parte profunda de los implantes. La asociación de disolución a nivel cristalino, la difusión del líquido biológico en los microporos y la reabsorción por macrófagos y células osteoclásticas de los materiales en la superficie y dentro de los macroporos involucra una sustitución ósea progresiva de los materiales por hueso fisiológico bien vascularizado. Este es el proceso común de reabsorción-absorción/ sustitución ósea de la cerámica de fosfato Cálcico Bifásico Micromacroporoso. La mezcla íntima del proceso desarrollado para MBCP+ matriz inteligente otorgó propiedades únicas y originales, contrario a algunos otros BCPS descritos en la literatura que emplean una mezcla mecánica de HA en un lado y B-TCP en el otro [14]. ´

Conclusión as tecnologías avanzadas para biocerámica matrices inteligentes osteogénicas para ingeniería de tejidos, involucraron una mayor eficacia de dichas matrices para mayores tecnologías quirúrgicas relevantes según la combinación de cirugía con médula ósea, o células madre expandidas in vitro para la ingeniería de tejidos óseos. El proyecto REBORNE fue capaz de demostrar esta estratégica en situaciones clínicas maxilofaciales y ortopédicas. La avanzada tecnología de biocerámica de MBCP+ involucró una mayor eficiencia de las matrices de fosfato cálcico para posteriores tecnologías quirúrigcas en renegeración de tejido óseo.

RECONOCIMIENTOS

Agradecemos al Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea SALUD-2009-1.4.2; por el estudio de Defectos Óseos Regenerativos utilizando Nuevos Enfoques de Ingeniería Biomédica (REBORNE, P. Layrolle coordinador). Agradecemos a todos los socios de REBORNE por sus contribuciones en el proyecto.

REFERENCIAS

[1] TL. Arinzeh, T. Tran, J. McAlary, G. Daculsi, Biomaterials. 26 (2005) 3631-3638.
[2] RF. Service, Tissue engineers build new bone, Science 289 (2000) 1498-1500.
[3] F. Jégoux et al., J Biomed Mater Res A 91(4) (2009) 1160-1169.
[4] F. Espitalier et al., Biomaterials 30 (2009) 763-769.
[5] G. Daculsi, F. Jegoux P. Layrolle, in Advanced Biomaterials: Fundamentals, Processing, and Applications book, Advanced Biomaterials: Fundamentals, Processing, and Applications, Bikramjit Basu, Dhirendra S. Katti, Ashok Kumar ed, John Wiley and sons Inc., 2009, pp.101-141.
[6] G. Daculsi et al., Key Engineering Materials. (2008) 361-363:1139-1142.
[7] G. Daculsi et al., J Mater Sci Mater Med 14(3) (2003) 195-200.
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[9] Yuan et al, Tissue Engineering (2006) 12:1607-15
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[13] G. Daculsi et al., (1990), 46, 20-27.
[14] R. Oliveira Lomelino et al., J. Mater. Sci.: Mater Med 23 (2012) 781-788.